نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 ارشد بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان، تبریز، ایران
2 دانشیار ، گروه بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان، تبریز، ایران
3 دانشیار ،گروه بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان، تبریز، ایران
چکیده
مقدمه: آنزیم RNA پلیمراز باکتریوفاژ T7، در رونویسی و بیان پروتئین‌های نوترکیب استفاده می‌شود. این آنزیم به فاکتور دیگری برای شناسایی پیشبر نیاز نداشته، بسیار اختصاصی عمل می‌کند و فقط ژن‌های تحت کنترل پیشبر T7 را بیان می-نماید. این ویژگی‌ها موجب شده است که تولید آنزیم T7 RNA پلیمراز در بیوتکنولوژی بسیار پر اهمیت باشد.
مواد و روشها: در این تحقیق، برای تولید انبوه و کم هزینه این آنزیم، سویه باکتریوفاژ T7 به‌عنوان الگو مورد استفاده قرار گرفت. واکنش PCR با استفاده از آغازگر‌های اختصاصی که حاوی سایت برشی برای آنزیم‌های BamHI و EcoRI بود انجام گرفت. پس از الکتروفورز محصول PCR، ژن تکثیر شدهT7 RNA پلیمیراز و پلاسمید pGEX2TK توسط این آنزیم‌ها برش داده شدند و پس از خالص‌سازی، واکنش لیگاسیون بین آن‌ها صورت گرفت. پلاسمید نوترکیب pGEX-T7RNAPol با الکتروپوراسیون به باکتری E. coli منتقل شد. گزینش باکتری‌های حاوی پلاسمید نوترکیب به کمک PCR انجام گرفت.
نتایج: پس از تایید پلاسمید حاصل، با برش آنزیمی و همچنین با PCR، توالی‌یابی آن انجام و درستی آن مطابق توالی ثبت شده در NCBI تایید شد. پلاسمید نوترکیب به منظور بیان پروتئین مورد نظر به باکتری E. coli سویه Rosetta منتقل شد. کلنی حاوی پلاسمید انتخاب وکشت شد. بیان پروتئین با القای IPTG در باکتری صورت گرفت و پس از استخراج به کمک SDS-PAGE تایید شد. این تحقیق پیش‌نیاز تولید تجاری و انبوه آنزیم T7 RNA پلیمراز می‌باشد که پس از بهینه‌سازی بیان و خالص‌سازی پروتئین، تولید تجاری و بومی آن انجام خواهد شد.
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Isolation, cloning and Expression of T7 RNA polymerase from T7 bacteriophage in E. coli in order to commercial production
نویسندگان [English]
- Leyla Davarvash 1
- Maghsoud Pazhouhandeh 2
- Mohammad Ahmadabadi 3
1 Master of Biotechnology, Faculty of Agriculture, Shahid Madani University of Azerbaijan, Tabriz, Iran
2 Associate Professor.Biotechnology Department, Azarbaijan Shahid Madani University, Km 35 Tabriz-Azarshahr Road, Tabriz, Iran
3 Associate Professor.Biotechnology Department, Azarbaijan Shahid Madani University, Km 35 Tabriz-Azarshahr Road, Tabriz, Iran
چکیده [English]
Introduction: T7 RNA polymerase from T7 bacteriophage has suitable features for using in recombinant protein expression or transcription systems. This enzyme does not require additional factors to identify its promoter, operates very specific and only express the genes under T7 promoter. The features of T7 expression system make it important in biotechnology. Therefore, due to the increasing importance of this enzyme, its mass production at low cost is greatly important.
Materials and Methods: In this research, T7 phage was applied and PCR reaction was performed using T7 RNAPol-specific primers containing the cutting sites for restriction enzymes. After the electrophoresis of PCR product, T7 RNAPol gene and pGEX2TK plasmid were digested by BamHI and EcoRI enzymes and after being purified, the ligation was performed between them. The recombinant pGEX-T7RNAPol plasmid was transformed into the E. coli, by electroporation. Bacterial positive colonies containing the recombinant plasmid were selected using PCR.
Results: After confirming the obtained plasmids by PCR and digestion, they were sequenced and the sequence analysis confirmed the exact T7 RNA polymerase gene according to NCBI accession sequence. This recombinant plasmid was transformed into Rosetta strain of E. coli in order to express. Its positive colonies were selected and liquid culture was carried out. T7 RNAPol protein expression in bacteria was done by inducing with IPTG and after extraction, it was confirmed by SDS-PAGE. This research is a prerequisite for T7 RNA Polymerase commercial and mass production that will be start after the optimization of its expression and purification methods.
کلیدواژه‌ها [English]
- T7 RNA polymerase
- T7 bacteriophage
- Transcription
- expression system
- recombinant proteins
)